Métodos para la
detección presuntiva de Huanglongbing (HLB) en cítricos
Methods for
presumtive detection of Huanglongbing (HLB) in Citrus
Juan José Garza-Saldaña1*, Sóstenes
Varela-Fuentes1, Wilfrido Gómez-Flores2
*Autor para correspondencia:jjgarza@docentes.uat.edu.mx/
Fecha de recepción: 27 de noviembre de 2015/ Fecha de aceptación: 23 de junio
de 2016
1Universidad Autónoma de Tamaulipas, Facultad de
Ingeniería y Ciencias, Centro Universitario Victoria, Ciudad Victoria,
Tamaulipas, México, C.P. 87149. 2Centro de Investigación y Estudios
Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Tamaulipas, Parque
Científico y Tecnológico TECNOTAM, km 5.5 carretera Ciudad Victoria-Soto La
Marina, Ciudad Victoria, Tamaulipas, México, C.P. 87130.
RESUMEN
Huanglongbing (HLB)
es considerada mundialmente como la enfermedad más amenazadora para la
citricultura, y ha impactado principalmente en Asia, Sudáfrica y Brasil. A la
fecha, no se cuenta con un tratamiento efectivo para la detección de esta
enfermedad, que pueda ayudar a disminuir su propagación y la consecuente
eliminación de árboles infectados. El método más confiable hasta ahora, para la
identificación del HLB, es la prueba de reacción en cadena de la polimerasa
(qrt-PCR), la cual es costosa y tardada. Esta es la primera revisión de los
diferentes métodos existentes o en desarrollo para la detección e
identificación del HLB; clasificados en métodos de análisis y reconocimiento de
patrones en imágenes, espectrofotométricos, cromatográficos y moleculares a través
del insecto vector. Algunos de estos métodos representan alternativas
innovadoras con diferente nivel de eficiencia en tiempo, costo y confiabilidad
en la detección de árboles enfermos de HLB o en el manejo de la enfermedad, con
relación a los tradicionalmente utilizados.
PALABRAS CLAVE: detección, Huanglongbing, HLB.
ABSTRACT
Huanglongbing (HLB) is considered worldwide as the most threatening disease for
citrus and has impacted mainly in Asia, South Africa and Brazil. Until now, no effective treatment for the detection of this disease
(is available, which can help diminish its spread and the consequent removal of
infected trees). The most reliable identification HLB test method to
date is the polymerase chain reaction (qrt-PCR),
which is costly and time-consuming. This is the first review of the different
existing or developing methods for HLB detection and identification, classified
into analysis and patternrecognition in images,
spectrophotometric, chromatographic and molecular through the insect vector. Some
of these methods represent innovative alternatives with different levels of
efficiency in time, cost and reliability in detecting diseased trees or in
managing the disease, compared to those traditionally used.
KEYWORDS: detection,
Huanglongbing, HLB.
INTRODUCCIÓN
La enfermedad más devastadora para los
cítricos a nivel mundial es el Huanglongbing (HLB);
se estima que ha causado la muerte de más de 63 millones de árboles,
principalmente en Asia, Sudáfrica y
Brasil (Robles-González y col., 2013; Santivañez y
col., 2013). Es una enfermedad de rápida diseminación, detectada por primera
vez en el hemisferio Occidental en 2004, en Brasil (Texeira
y col., 2005); en agosto de 2005 se reportó el primer brote en Florida, Estados
Unidos (Halbert, 2005), y desde entonces se extendió a todos los condados de dicho estado y a algunos condados productores
de California y Texas (Choi y col., 2013). Se
considera que entre 2004 y 2011 disminuyó en un 28 % la superficie citrícola
comercial de Florida, y con ella el número de árboles en producción, siendo el
HLB una de las principales razones (Pourreza y col.,
2015).
En México, la enfermedad se detectó por
primera vez en julio de 2009, en árboles de
limón mexicano, en áreas urbanas de la península de Yucatán. Posteriormente, se
reportó en árboles de la misma especie en los estados de Nayarit y Jalisco, y
en 2010 en Colima (SENASICA, 2015a); en este último estado, hasta diciembre de
2010, se habían detectado 164 359 árboles de
limón mexicano con síntomas atribuibles al HLB, en 1 062 plantaciones ubicadas en diferentes zonas
productoras (Robles-González y col., 2013). En noviembre de 2015, el HLB se
encontraba presente en 347 municipios, pertenecientes a 18 de los 24 estados
que cultivan cítricos en México (Figura 1) (SENASICA,
2015b).
El HLB es causado por bacterias gram-negativas del género Candidatus
Liberibacter; denominado Candidatus,
por pertenecer al tipo de microorganismos
que no es posible cultivarlos en el laboratorio con las técnicas tradicionales, lo que dificulta
su caracterización y clasificación. El nombre Liberibacter es una palabra compuesta, proveniente de dos vocablos del latín liber (corteza) y bacter (bacteria).
Se reconocen tres tipos causantes de esta enfermedad: Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus y
Candidatus Liberibacter
americanus (Bové, 2006; Santiváñez
y col., 2013). Estas bacterias son introducidas por un organismo vector en el floema de la planta hospedera, y al moverse, a través del sistema vascular, la contaminan
en su totalidad, causando su muerte después de 2 a 3 años
(Robles-González y col., 2013).
Los árboles gravemente afectados tienen
manchas moteadas en hojas, hojas más pequeñas con algunos síntomas de
deficiencia de nutrientes, así como venas de color amarillo. Además, las frutas
infectadas con HLB muestran colores anormales, formas irregulares, sabor
amargo y presentan semillas abortadas.
Estos síntomas pueden utilizarse para el diagnóstico de la enfermedad,
pero son imprecisos, por lo que se requiere su confirmación (Gonzalez y
col., 2012; Pourreza
y col., 2015). Las bacterias asiática y americana, que causan el HLB, se
transmiten a través de un vector
común, el psílido Diaphorina
citri (Kuwayama); en
tanto que la bacteria africana es transmitida por el psílido
Trioza erytreae (Del
Guercio) (Albrecht y Bowman, 2008; Santivañez y col.,
2013).
Actualmente, no existe un tratamiento
efectivo para el HLB, por lo que se requiere su detección temprana, para proceder a la
eliminación de los árboles infectados,
lo que puede ayudar a minimizar y controlar la propagación de la enfermedad a
otros árboles en el huerto y la región en general (Pourreza
y col., 2015).
En el presente documento se analizan los
métodos comúnmente utilizados y los métodos innovadores propuestos para la
detección del HLB en cítricos (Figura 2), clasificándolos en: métodos de
análisis y reconocimiento de patrones de la enfermedad en imágenes a través de
cámaras, métodos que adquieren información espectroscópica a través
de dispositivos y otros basados en
cromatografía y de detección molecular a través del insecto vector.
Métodos comunes para la detección del HLB
Para la detección de HLB se utilizan dos
métodos comunes: la inspección visual de los
síntomas y la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (qrt-PCR, por sus
siglas en inglés: Polymerase Chain Reaction);
ambos métodos son costosos, por la cantidad de recursos que utilizan, y
consumen tiempo. Con relación a la eficiencia del diagnóstico (Futch
y col., 2009), en un estudio realizado por
inspectores profesionales en el condado de DeSoto,
Florida, Estados Unidos, mostraron que la exactitud de la identificación de un
árbol infectado con HLB mediante
inspección visual es entre 47 % y 59 %.
Por otra parte, la prueba de reacción
cuantitativa en tiempo real de la cadena de la
polimerasa (qrt-PCR)
puede identificar el estado de HLB con mayor precisión, ya que es una prueba de diagnóstico basada en métodos de laboratorio (Pourreza y col., 2015).
Métodos basados en otras técnicas para la detección del HLB
La existencia de métodos rápidos y fáciles
para detección de enfermedades de las plantas, mejoran indirectamente la productividad de la agricultura e impiden importantes pérdidas en el sector
agrícola. Una de las principales herramientas para la detección de enfermedades
es el empleo del espectro electromagnético, que es el conjunto de longitudes de
onda de todas las radiaciones electromagnéticas, incluyendo los rayos gamma,
los rayos X, la radiación ultravioleta (UV), la luz visible (espectro visible),
la radiación infrarroja (IR) y las ondas radioeléctricas (Gonzalez
y Woods, 2008).
Sankaran y col.
(2010b), mostraron diferentes métodos para la detección de varias enfermedades como:
espectroscopia fluorescente para la detección de canker en cítricos,
espectroscopia visible e infrarroja,
para la detección de infestación de chicharrita de color marrón (Nilaparvata lugens) en plantas de arroz, e imágenes hiperespectrales,
para la detección de sarna del trigo
(Fusarium head blight), entre otros.
El empleo del espectro electromagnético,
apoyado de visión artificial, es uno de los enfoques de mayor éxito en el
control y detección de enfermedades,
tanto para árboles como para cultivos herbáceos. Se muestran dos clases de técnicas para la
detección de HLB que utilizan imágenes de hojas o árboles de cítricos: la
primera hace uso de imágenes adquiridas en el espacio de color visible,
específicamente imágenes en color (RGB, del inglés Red, Green, Blue); en la
segunda, algunos trabajos utilizan combinaciones de imágenes del espectro
electromagnético visible y no visible al ojo humano y son adquiridas por
cámaras especiales. El HLB también se detecta utilizando diferentes dispositivos electrónicos que
adquieren datos del espectro electromagnético, sin el empleo de imágenes, en
función del
objeto al cual son dirigidos (hojas o árboles). Los métodos que no utilizan las
técnicas anteriores fueron clasificados en este trabajo
como otros métodos de detección (Figura 2).
Análisis de imágenes y reconocimiento de patrones por
computadora
En esta sección se revisaron métodos que
utilizan imágenes de cámaras digitales y cámaras espectroscópicas.
Imágenes dentro del espectro visible
Microscopio
Kim y col. (2009), evaluaron con imágenes
extraídas a través de un microscopio digital (VHX-600K con lentes OP-51479, Keyence,
Japón) la capacidad de co-ocurrencia
de características de hojas de cítricos, utilizando una selección de 420
imágenes de hojas con dimensiones de 1 600 pixeles por 1 200 pixeles, adquiridas en el espacio
de color RGB y convertidas al espacio HSI (del inglés Hue,
Saturation, Intensity);
las imágenes fueron clasificadas por personal experto en siete clases sintomáticas: reverdecimiento moteado con manchas, con islas verdes, deficiencia de
hierro, deficiencia de magnesio, deficiencia de zinc, hojas de brotes jóvenes
y hojas maduras normales. También emplearon un análisis discriminante por pasos, con fines de selección
y clasificación de características de las imágenes. Se originaron tres funciones de clasificación, que al utilizarlas generaron algoritmos clasificadores, los cuales permitieron una precisión de clasificación de 86.7
%, cuando se consideraron todas las clases; sin
embargo, la exactitud aumentó a 97.3 %, cuando se omitieron en el algoritmo de
clasificación las clases de hojas de brotes jóvenes y de color moteado con
manchas.
Cámara
Deng y col. (2014), propusieron un método para reconocer el
HLB, basado en el análisis de RGB. Utilizaron una base de datos de 216 imágenes
de hojas, clasificadas por expertos, en: sanas, enfermas con HLB, con síntomas
atenuados de HLB por tratamientos, amarillas y con deficiencia de zinc. Las
imágenes fueron obtenidas con diferentes cámaras, iluminación, resolución y
ángulo. En la etapa de entrenamiento se obtuvieron imágenes de las diferentes
hojas, pertenecientes a cada una de las clases mencionadas y se analizaron sus
características. Estas se colocaron en una estructura de datos denominada árbol
ponderado de vocabulario escalable (WSVT, por sus siglas en inglés: Weighted Scalable Vocabulary Tree). Posteriormente,
en la etapa de reconocimiento de la imagen de la hoja a clasificar se extrajo
también un WSVT, que se comparó con la base de datos obtenida en la fase de
entrenamiento y se identificó la clase a la que pertenecía la imagen. Los resultados mostraron una exactitud entre 95 % y 100 %, con tiempos inferiores a 1 s.
Imágenes
espectroscópicas
Las técnicas espectroscópicas permiten
identificar moléculas desconocidas, ya que pueden medir las longitudes de
enlace y determinar las constantes de fuerza asociadas a los enlaces químicos.
Están basadas en determinar las transiciones que tienen lugar entre diferentes
estados de energía de las moléculas, cuando interactúan con
la radiación electromagnética (Engel
y Reid, 2006). Se han probado diferentes
métodos que utilizan la visión por computadora para detectar HLB, en los que se
aprovechan las características que proveen las imágenes espectroscópicas, como
se muestra a continuación.
Luz polarizada
Las hojas infectadas con HLB presentan un
alto contenido de almidón (Etxeberria y col., 2009),
lo cual ha sido utilizado para diagnosticar la presencia de esta enfermedad (Gonzalez
y col., 2012). Pourreza y col. (2014), mostraron los
resultados del estudio de acumulación de almidón en hojas de
cítricos HLB-sintomáticas, donde esta acumulación hizo girar el plano de polarización de la luz a 591 nm, capturando esta reflectancia
con cámaras monocromáticas. Siete algoritmos clasificadores fueron evaluados y
se consideraron tres clases de muestras (deficiencia de magnesio, HLB-positivo
con deficiencia de zinc y HLB-negativo con deficiencia de zinc), en el proceso
de clasificación, para confirmar la capacidad de detección de almidón en el
sistema; se obtuvieron precisiones de 93.1 % y 89.6 % en promedio para las
variedades “Hamlin” y “Valencia”, respectivamente.
Pourreza y col. (2015), haciendo uso del mismo principio de
acumulación de almidón en las hojas de los cítricos, utilizaron un sensor de
visión desarrollado para el propósito de detección en tiempo
real del HLB en condiciones de campo; el sensor pudo detectar la infección directamente sobre la
copa del árbol e incluyó una cámara monocromática altamente sensible, LEDs de alta potencia de banda-estrecha y filtros
polarizados. Los resultados detectaron HLB en el rango de 95.5 % a 98.5 % en
pruebas de campo y laboratorio, y las muestras HLB-negativas fueron
clasificadas con 100 % de precisión en los conjuntos probados.
Infrarrojo Cercano
El infrarrojo cercano es la radiación del
espectro luminoso que se extiende desde el extremo del rojo visible hacia frecuencias mayores (Gonzalez y Woods, 2008). Mishra y col. (2007), reportaron que las regiones
de longitudes de onda en el espectro visible, de 530 nm a 564 nm
(pico verde) y las del rango 710 nm a 715 nm (borde rojo), así como dos longitudes de onda de la
región del infrarrojo cercano (1 041 nm y 2 014 nm), tuvieron la capacidad de discriminar entre árboles sintomáticos de HLB y sanos.
Sankaran y col. (2013), demostraron también la aplicabilidad de espectroscopia del infrarrojo cercano visible, además de imágenes térmicas para la
detección de HLB en árboles de cítricos. Tres cámaras (dos multiespectrales
de 6 bandas y una térmica), montadas sobre el mástil deun
vehículo, se utilizaron para adquirir las imágenes. Las cámaras multiespectrales
se configuraron para obtener imágenes en 12 bandas
en el rango de 440 nm a 990 nm.
Los algoritmos de clasificación utilizando valores promedio de la reflectancia
espectral visible y las bandas térmicas como características de entrada, con el
método de Máquinas de Soporte Vectorial (SVM, por sus siglas en inglés: Support Vector Machine), indicaron una precisión global de
clasificación positiva media alrededor del 87 % para árboles con hojas
sintomáticas. Las SVM son conjuntos de algoritmos de aprendizaje supervisado,
que construyen un modelo que predice si un elemento nuevo, cuya categoría se
desconoce, pertenece a una categoría o a la otra.
Fotografía aérea
Estos métodos son capaces de detectar
áreas infectadas, abarcando grandes superficies de cultivo; pero dependen de la
precisión en la verificación por tierra del área muestreada y los algoritmos
clasificadores implementados. Algunos de ellos utilizan imágenes de cámaras multiespectrales (MS), que permiten capturar la información
de varias bandas del espectro (típicamente de 4 a 7); o hiperespectrales
(HS), que se obtienen al capturar un mayor número de bandas (Amro y col., 2011).
La detección del HLB, utilizando imágenes
obtenidas desde un aeroplano, ha sido reportada
en varios trabajos. Kumar y col. (2010),
emplearon imágenes aéreas HS y MS y realizaron la prueba de PCR en muestras
vegetales, para comprobar la presencia de HLB en árboles infectados en una
zona bajo análisis. Se registraron las
coordenadas de latitud y longitud a través de un dispositivo receptor de
GPS y se generó una librería derivada de las imágenes espectrales y las
coordenadas. Se logró una precisión en la detección de 80 %, utilizando Mixture Tuned
Match Filtering (MTMF, por sus siglas en inglés) con la imagen HS;
para el filtro de mapeo de ángulo espectral
(SAM, por sus siglas en inglés: Spectral Angle Mapping): con imagen MS la
precisión fue de 87 %.
Li y col. (2012), emplearon imágenes
aéreas HS y MS, de plantaciones de
cítricos, en Florida, Estados Unidos,
obtenidas durante el 2007 y 2010. La precisión de detección para HLB fue mayor
a 90 %, con un método sencillo de umbral
de posición de borde rojo (REP, por sus siglas en inglés: Red Edge Position). Años más tarde, Li y col. (2014),
propusieron un algoritmo denominado mapeo de ángulos espectrales extendido
(ESAM, por sus siglas en inglés: Spectral Angle Mapping), en el cual, el
algoritmo SVM fue utilizado para separar las copas de los árboles del fondo, y
el método ESAM logró una precisión de detección del 86 %, utilizando imágenes HS.
Garcia-Ruiz y col. (2013), obtuvieron imágenes aéreas
de un área de interés específica, utilizando un vehículo aéreo no tripulado (UAV, por sus siglas en
inglés: Unmanned Aerial Vehicle), o dron equipado con una cámara de alta
resolución, con sensores de imagen multi-banda,
ajustando la resolución deseada de acuerdo a la altitud de vuelo. Los
resultados obtenidos se compararon con resultados de imágenes adquiridas desde
un aeroplano y que tienen una resolución inferior. Previo a la adquisición de
imágenes, se identificaron y ubicaron con GPS en el área de interés, 19 árboles
sanos y 19 árboles con HLB (detectados por PCR). Durante el proceso de
clasificación se separó o segmentó el suelo con respecto a la copa de los
árboles. En el análisis se comparó la eficiencia de cuatro algoritmos: análisis
lineal, de discriminante cuadrática, SVM con ajuste lineal y no lineal (de kernel); con este último se obtuvo una precisión mayor, en
el rango del 67 % a 85 % con datos del UAV y 61 % a 74 % con datos del
aeroplano.
Fotografía satelital
Li y col. (2015), utilizaron el análisis
de imágenes satelitales MS con una resolución de 2 m, adquiridas por el
satélite WorldView-2, como una forma rápida para monitorear HLB en grandes
extensiones. A la vez, realizaron una exploración por tierra, y se construyeron
dos bibliotecas espectrales: la
Biblioteca 1 con ubicaciones Real Time Kinematic (RTK, por sus siglas en
inglés), GPS para obtener exactitud submétrica;
y la Biblioteca 2 con el conocimiento previo de
las características espectrales de la exploración por tierra, con el fin de
comparar la precisión de detección del HLB de trabajos previos que utilizan
imágenes espectrales aéreas (con los mismos algoritmos de clasificación). La
distancia de Mahalanobis tuvo la mayor
precisión con un 81 %, utilizando la
Biblioteca 2. Lo que indica que la imagen satelital MS, con una resolución
espacial adecuada, presenta potencial para la detección del HLB.
Espectroscopia de imágenes fluorescentes
Fluorescencia es la propiedad que tienen
algunas sustancias de reflejar luz con mayor longitud de onda que la recibida
cuando están expuestas a ciertos
rayos del espectro (Engel y Reid,
2006). Wetterich y col. (2012),
desarrollaron y evaluaron un método
de visión por computadora y técnicas de aprendizaje automático para la
clasificación de hojas con HLB y hojas sanas, utilizando un dispositivo
personalizado de espectroscopia de imágenes fluorescentes con una cámara
monocromática. Las características extraídas de las
imágenes fueron utilizadas como entradas de diferentes algoritmos clasificadores, y encontraron que el algoritmo
SVM puede clasificar intensidades de fluorescencia de
hojas infectadas de HLB hasta con 90 % de precisión. Por otro lado, al comparar la
intensidad de fluorescencia de hojas de cítricos recolectadas en Brasil y los
Estados Unidos esta fue diferente.
Pereira y col. (2011), estudiaron el uso
potencial de imágenes de fluorescencia inducida por láser (LIFI, por sus siglas
en inglés: Laser-Induced Fluorescence
Imaging), para detección de HLB en naranja dulce (Citrus
sinensis), a través de un experimento,
en el que verificaron la respuesta de fluorescencia, durante un periodo de ocho meses después de la inoculación bacteriana de
60 árboles. Utilizaron el sistema de LIFI, a 473 nm
de longitud de onda de excitación, para tomar fotografías de fluorescencia de
hojas de la planta y encontraron que el método propuesto fue capaz de
identificar el 95 % de las plantas con
HLB, aun en etapas tempranas de la enfermedad
(primeros meses), antes de la aparición
de los síntomas visuales.
Espectroscopia
En esta sección se muestra la utilización
de datos de espectroscopia capturados a través de varios dispositivos
electrónicos y que no utilizan procesamiento de imágenes durante su análisis.
Infrarrojo Cercano
Al analizar las hojas de los árboles de
cítricos para la detección del HLB, Sankaran y col.
(2011), utilizaron un espectroradiómetro portátil,
donde extrajeron 86 características espectrales en el rango visible y del
infrarrojo cercano, entre 350 nm y 2 500 nm con intervalos de 25 nm.
Obtuvieron un conjunto de datos combinados mediante el análisis de componentes
principales (PCA),
que se utilizaron en varios clasificadores,
alcanzando un 95 % de precisión, cuando
se empleó el conjunto de datos de la segunda derivada, y el clasificador
denominado análisis de discriminante cuadrático (QDA).
En otro estudio, Sankaran
y Ehsani (2011), evaluaron las características de los
mismos espectros, incluyendo además reflectancia
espectral e índices de vegetación en condiciones de
laboratorio y de campo, encontrando
que el uso de ambos tipos de características puede resultar en una precisión de
clasificación mayor al 80 %.
Mishra y col. (2011), evaluaron un sensor óptico activo, multibanda, de
bajo costo y portátil, conectado a una PDA (Personal Digital Assistant),
para identificar los árboles infectados con HLB de los árboles sanos. El sensor
medía la reflectancia de las copas de los árboles en
cuatro bandas: dos bandas visibles a 570 nm y 670 nm, y dos bandas de infrarrojo cercano a 870 nm y 970 nm; con esta información calcularon 11 diferentes índices y se utilizaron como entradas de manera combinada
en cinco algoritmos clasificadores: árboles de
decisión (KNN, por sus siglas en inglés: K-Nearest Neighbours), regresión logística, redes neuronales y SVM. Se obtuvo una precisión de 97
% para la detección de HLB usando algoritmos basados en SVM y árboles de toma
de decisiones. En un estudio separado, Mishra y col.
(2012), utilizando dos espectroradiómetros
portátiles y una computadora,
lograron una precisión de detección de HLB mayor a 90 %, usando múltiples
observaciones y un algoritmo clasificador SVM o KNN ponderado.
Infrarrojo medio
La espectroscopia del infrarrojo medio fue empleada por Sankaran y col. (2010a), para identificar la presencia de
infección de HLB en hojas de cítricos, contrastando sus espectros con los de
hojas con deficiencia de nutrientes y hojas sanas. Las hojas enfermas fueron detectadas a través del análisis de PCR, las sanas
y con deficiencia de nutrientes fueron
determinadas por un grupo de expertos entrenados.
Con este método demostraron que con la firma espectral adquirida en el rango de 5.15
μm a 10.72 μm, el
algoritmo KNN es capaz de
identificar la infección de HLB en
hojas con una exactitud de más del 90 %.
Fluorescencia
Sankaran y Ehsani (2013), utilizaron un
sensor de fluorescencia de mano para identificar HLB en etapas
sintomáticas y asintomáticas de las hojas de cítricos de diferentes variedades.
Los resultados indicaron que el algoritmo bagged
decision tree (BDT), clasificó
con 97 % de precisión las hojas
sanas y sintomáticas. Aunque las muestras
asintomáticas de los árboles infectados con HLB (en los resultados del análisis de PCR) , no
pudieron ser clasificadas, el clasificador Naïve-Bayes
agrupó la mayor parte de las muestras asintomáticas como HLB.
Espectrometría infrarroja
con transformada de Fourier (FTIR)
Hawkins y col. (2010), emplearon un
espectrómetro de infrarojo por transformada de
Fourier y como accesorio un cristal de
diamante ATR (FTIR-ATR, por sus siglas en inglés: Fourier Transform
Infrared–Attenuated Total Reflection) para detectar hojas infectadas con HLB. Con este
método, la hoja debe estar seca y triturada antes del análisis. Más del 95 % de
las 179 muestras en este estudio fueron correctamente identificadas. Contrario
a la prueba de PCR, que puede tardar horas, los resultados a través de este
método son obtenidos en minutos.
Otros métodos de detección
En esta sección se describen los métodos
de detección que utilizan técnicas diferentes al análisis y reconocimiento de
patrones y la espectroscopia .
Cromatografía de gases
Los organismos vivos producen compuestos
orgánicos volátiles (VOCs, por sus siglas en inglés: Volatile Organic Compounds), de
manera natural y específica, lo que puede ser aprovechado para detectar
diferentes enfermedades, incluso en etapas tempranas en las que aún no aparecen
los síntomas visuales y usualmente se realizan a bajo
costo comparado con los
métodos comunes. Aksenov y col. (2014), establecieron un método de detección de la enfermedad del HLB basado en el análisis químico de VOCs, liberados por
los árboles infectados; encontrando biomarcadores o “huellas digitales” específicas para el patógeno que causa la
enfermedad, y que pueden interpretarse utilizando métodos
analíticos, tales como cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS, por
sus siglas en inglés: Gas Chromatography/Mass Spectrometry) y
cromatografía de gases/espectrometría
diferencial de movilidad (GC/DMS, por
sus siglas en inglés: Gas Chromatography/Defferential Mobility Spectrometer). Este
método de detección tiene una exactitud cercana al 90 % durante todo el año,
acercándose al 100 % bajo condiciones de laboratorio óptimas, incluso en etapas
muy tempranas de la infección donde otros métodos no son adecuados.
Detección a través del insecto vector
La bacteria Candidatus
Liberibacter asiaticus
(CLas), asociada con el HLB, se transmite por Diaphorina citri Kuwayama, el psílido asiático de
los cítricos. Keremane y col. (2015), emplearon psílidos para evaluar la presencia de CLas
en una población de insectos, como una herramienta para la detección
temprana del HLB en nuevas áreas invadidas por el psílido.
Los autores reportaron el desarrollo de un kit de detección molecular de campo
para diagnosticar psílidos con CLas,
utilizando tecnología de amplificación cíclica (LAMP, por sus siglas en
inglés: Loop-Mediated
Amplification Technology),
que permite analizar seis muestras con grupos de 1 a 10 psílidos,
además de un control positivo y negativo en aproximadamente 30 min. Los
ensayos de LAMP se realizan en una unidad de detección Smart-DARTTM, que
es operado desde un dispositivo móvil con sistema operativo Android. El
método de detección de LAMP para CLas es
aproximadamente 100 veces más sensible que el método tradicional de PCR en
tiempo real, por lo que puede ser útil en áreas donde la epidemia está en las etapas iniciales.
El HLB y su
detección
La mayoría de los diferentes métodos
empleados para la detección de HLB, que fueron mostrados en este trabajo,
proveen detección basada en algoritmos de aprendizaje de máquina (Machine Learning) o aprendizaje automático, debido a la complejidad
del problema de detección. En general, se utilizan dos enfoques: el primero es
el aprendizaje supervisado, que corresponde a algoritmos que tienen como meta
aproximar a una función objetivo, y que describen cómo los elementos del problema
deben ser clasificados de acuerdo a una clasificación previa (usualmente
realizada por personal experto en el área), por medio de una función llamada
clasificador, por lo tanto
requieren una colección inicial de ejemplares clasificados. Por otro lado, el aprendizaje no
supervisado incluye algoritmos en los que no se dispone de ejemplares
previamente clasificados, sino que a
partir de las propiedades de los
mismos ejemplares se intenta dar una clasificación según su similitud. En este tipo se incluyen los algoritmos de agrupamiento (clustering).
En la Tabla 1 se muestran los métodos para
detección de HLB, con su respectivo porcentaje de precisión, en la detección,
así como su clasificación. En los métodos revisados, la enfermedad fue
detectada en la planta a través de los síntomas que mostraba, excepto en el
trabajo desarrollado por Keremane y col. (2015), que
identificaron la bacteria en los psílidos; y en el de
Aksenov y col. (2014), quienes también la detectaron
en los VOCs. Por otro lado, los
métodos de detección basados
únicamente en imágenes a color de cámaras digitales (Deng
y col., 2014), así como de microscopio (Kim y col., 2009), tienen la desventaja
de ofrecer resultados sólo cuando los síntomas de la enfermedad son evidentes en las hojas, sin embargo,
debido a la dificultad que presenta la detección de la enfermedad, aún
para personal experto (Futch y col., 2009), son una opción viable cuando los
recursos de equipo adicional no
están disponibles. Aksenov y col. (2014), quienes detectaron la enfermedad a través de
análisis de gases, proveen buenos resultados, pero tienen la desventaja de las condiciones
meteorológicas, particularmente el viento, al utilizarse en campo, que influyen
en un análisis preciso. Por otra parte, los métodos que
requieren recolectar muestras de follaje
y la detección a través del insecto vector (Keremane
y col., 2015), no consideran el tiempo de captura de las muestras para realizar
el análisis, lo cual incrementa el tiempo para obtener el resultado por
cada muestra, por lo que al aplicarse en campo pueden consumir grandes
cantidades de tiempo.
Los métodos que no requieren hacer
contacto con el área afectada ofrecen mayor rapidez en la detección. Pourreza y col. (2015) y Sankaran
y Ehsani (2013), mostraron dispositivos que pueden
ser colocados sobre un vehículo terrestre y detectar el HLB a cierta distancia
del árbol, con una eficiencia de detección superior al 95.5 %. Por otro lado,
la utilización de imágenes aéreas o satelitales (Kumar
y col. 2010; Li y col., 2014; Li y col., 2015), proveen la ventaja de localizar
la enfermedad en grandes extensiones de plantaciones. En cuanto a resolución o
grado de detalle de las imágenes, los UAV o drones,
adquieren
imágenes con resolución mayor, seguidas por las obtenidas a través de un
aeroplano y finalmente las satelitales, sin embargo, la diferencia en los
resultados de detección para HLB de 85 %
para imágenes de UAV (Garcia-Ruiz y col., 2013), 86 % aéreas (Li y col., 2014) y 81 % satelitales (Li y col., 2015) no es
significativa.
CONCLUSIONES
Ante el riesgo sanitario que representa el Huanglongbing (HLB), a la citricultura mundial, y al no existir por el momento un método que elimine por completo
la enfermedad, su detección rápida y oportuna con consecuente eliminación del árbol,
son actualmente la única forma de evitar el establecimiento y dispersión de la
enfermedad. Los métodos para la detección de HLB que utilizan fotografía aérea
o satelital, permiten el monitoreo de grandes superficies, sin embargo, su
precisión actual no es suficiente para adoptarlos como métodos oficiales y son
costosos en función del número de bandas del espectro que utilizan. Por otro
lado, los métodos que alcanzan precisiones similares a la prueba de PCR
obtienen resultados en corto tiempo, pero requieren la cercanía con el objeto
de estudio, lo cual es un gran inconveniente, ya que los huertos tienen grandes
extensiones. Por lo tanto, un sistema que considere el alcance amplio de los
métodos de fotografía aérea o satelital, con la validación a través de un
método de detección de corto alcance, representa la mejor opción para una
detección oportuna.
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